ОЦЕНКА ПРОФИЛЯ N-ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ МОЛЕКУЛЫ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VIIа

DOI: https://doi.org/10.29296/24999490-2020-04-08

О.Б. Устинникова(1), кандидат биологических наук, О.Б. Рунова(1), кандидат химических наук, А.А. Мовсесянц(1), доктор медицинских наук, профессор, Р.Р. Шукуров(2), кандидат биологических наук, М.А. Смолов(2), кандидат химических наук, Р.А. Хамитов(2), доктор медицинских наук, профессор 1-ФГБУ«Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Российская Федерация, 127051, Москва, Петровский б-р, д. 8, стр. 2; 2-ООО «Международный биотехнологический центр «Генериум»», Российская Федерация, 601125, Владимирская область, пос. Вольгинский, ул. Владимирская, д. 14 E-mail: ustinnikova@expmed.ru

Введение. Специфическая коагуляционная активность фактора свертывания крови VIIа зависит от наличия в молекуле данного белка N-ацетилнейраминовой (сиаловой) кислоты и фосфатных остатков. В связи с этим в качестве одного из критериев эффективности и безопасности лекарственных препаратов, содержащих данный белок, необходимо подтверждение подлинности профиля гликозилирования. Вместе с тем возможная вариабильность посттрансляционных модификаций требует индивидуального подхода к их оценке в соответствии с требованиями и рекомендациями по сравнению биоподобных препаратов. Материал и методы. В качестве объектов исследования использовали оригинальный препарат «НовоСэвен», биоподобный лекарственный препарат «Коагил-VII» и европейский референсный образец Human coagulation factor VIIa (rDNA) CRS. Для анализа олигосахаридной части применяли методы анионообменной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии гидрофильного взаимодействия с флюоресцентным и масс-спектрометрическим детектированием. Результаты. В ходе исследования установлен основной набор модификаций молекул рекомбинантного фактора свертывания крови VIIa, представленный комплексными биантенными олигосахаридами с незначительным присутствием триантенных структур. Для биоподобного лекарственного препарата наиболее характерной является модификация дисиалированной галактозилированной комплексной группой с одним остатком фукозы. Заключение. Оценка профиля N-гликозилирования рекомбинантного фактора свертывания крови VIIa, основанная на сравнительном анализе биоподобного препарата, оригинального препарата и стандартного образца CRS выявила различия в количественном содержании гликанов при общем совпадении времен удерживания основных пиков всех образцов. Масс-спектрометрическое исследование позволило осуществить структурную интерпретацию полученных хроматографических данных. На примере биоподобного препарата показана необходимость использования при подтверждении подлинности гликопрофиля в качестве образца сравнения аттестованного установленным образом стандартного образца предприятия.

Список литературы: 
  1. Sutkeviciute I., Mistiniene E., Sereikaite J., Bumelis V. The influence of different glycosylation patterns on factor VII biological activity. Biochimie. 2009; 91: 1123–30.
  2. Jurlander B., Thim L., Klausen N., Persson E., Kjalke M., Rexen P., Jorgensen T., Ostergaard P., Erhardtsen E., Bjorn S. Recombinant activated factor VII (rFVIIa): characterization, manufacturing and clinical development. Semin. Thromb. Hemost. 2001; 27: 373–84.
  3. Руководство по биоподобным биологическим лекарственным препаратам, содержащим в качестве действующего вещества белки биотехнологического происхождения: вопросы качества EMEA/CHMP/BWP/49348/2005.
  4. [Rukovodstvo po biopodobnym biologicheskim lekarstvennym preparatam, soderzhashchim v kachestve deystvuyushchego veshchestva belki biotekhnologicheskogo proiskhozhdeniya: voprosy kachestva EMEA/CHMP/BWP/49348/2005 (in Russian)]).
  5. Гармонизированное трехстороннее руководство ICH. Спецификации: Методы испытаний и критерии приемлемости биотехнологических/биологических препаратов. Q6B. 1999.
  6. [Garmonizirovannoe trekhstoronnee rukovodstvo ICH. Spetsifikatsii: Metody ispytaniy i kriterii priemlemosti biotekhnologicheskikh/biologicheskikh preparatov. Q6B. 1999 (in Russian)].
  7. Нормативные правовые акты в сфере обращения лекарственных средств в рамках Евразийского экономического союза. Т. 3. Правила проведения исследований биологических лекарственных средств Евразийского экономического союза. М., 2017; 352.
  8. [Normativnye pravovye akty v sfere obrashcheniya lekarstvennykh sredstv v ramkakh Evraziyskogo ekonomicheskogo soyuza. T. 3. Pravila provedeniya issledovaniy biologicheskikh lekarstvennykh sredstv Evraziyskogo ekonomicheskogo soyuza. M., 2017; 352 (in Russian)].
  9. Ceroni A., Maass K., Geyer H., Geyer R., Dell A., Haslam S.M. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. J. Proteome Res. 2008; 7: 1650–9.
  10. Ranzinger R., Herget S., von der Lieth C.-W., Frank M. GlycomeDB – a unified database for carbohydrate structures. Nucleic Acids Res. 2011; 39: 373–6.
  11. Klausen N., Bayne S., Palm L. Analysis of the site-specific asparagine-linked glycosylation of recombinant human coagulation factor VIIa by glycosidase digestions, liquid chromatography and mass spectrometry. Mol. Biotechnol. 1998; 9: 195–204.
  12. Böhm E., Seyfried B., Dockal M., Graninger M., Hasslacher M., Neurath M., Konetschny C., Matthiessen P., Mitterer A., Scheiflinger F. Differences in N-glycosylation of recombinant human coagulation factor VII derived from BHK, CHO, and HEK293 cells. BMC Biotechnol. 2015; 15: 87–101.
  13. Ghaderi D., Taylor R., Padler-Karavani V., Diaz S., Varki A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nature Biotechnol. 2010; 28: 863–7.