AGE-RELATED FEATURES OF THE SIGNAL MOLECULES’S PROFILE IN ENDOMETRIUM: PERSPECTIVES FOR DIAGNOSIS OF GYNECOLOGICAL PATHOLOGY

DOI: https://doi.org/None

I.Ju. Grigorian (1), V.O. Polyakova (2), N.S. Linkova (1,3), E.O. Kukanova (3), E.M. Paltseva (4) 1 -Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, Dunamo pr. 3, Saint Petersburg, 197110, Russian Federation; 2 -D.O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Mendeleyevskaya line, 3, Saint Petersburg, 199034, Russian Federation; 3 -Saint Petersburg State Polytechnical University, Polytechnicheskaya str. 29, Saint Petersburg, 195251, Russian Federation; 4 -B.V. Petrovsky Russian Surgery Research Center, Abrikosovskii per. 2, GSP-1, Moskow, 119991, Russian Federation

Introduction. Determination of the functional activity of the endometrium at the molecular-cellular level opens new perspectives for diagnosis and correction processes of accelerated aging and pathology of the female’s reproductive system. Objective – learning of the functional activity of the endometrium and the identification of the most important markers of the age-related features of the endometrium in women of all ages. Methods. We used a method of creating a primary culture of endometrial cells, immunocytochemical method, light microscopy, morphometry and statistical data processing. Results. During aging of the endometrium the greatest changes affect its ability to innovate. Thus, the expression proliferating protein Ki67 and marker of angiogenesis CD34 in the cell culture of the endometrium with age has declined by more than 6 times. Expression of proapoptotic proteins p53 and Caspase-3 was decreased in 1,5-2 times. Expression of receptors to estrogen (ER) and progesterone (PR) in Возрастные особенности профиля сигнальных молекул эндометрия... Молеккуулярная медицина №3, 2015 49 ВВЕДЕНИЕ Нарушение репродуктивной функции у женщин разного возраста является актуальной проблемой современной медицины. Прогнозируемое снижение репродуктивного потенциала в России определяет не только медицинскую, но и социально-экономическую актуальность проблемы оптимизации репродуктивного здоровья женщин [3]. Эндометрий является динамически реконструктирующейся тканью, которая, реагируя на половые стероидные гормоны, претерпевает рост и трансформацию, отторгаясь и регенерируя более 400 раз в течение активного репродуктивного периода женщины. Эти изменения носят циклический характер и строго подчиняются воздействиям системы гипоталамус–гипофиз–яичники. С возрастом частота патологии эндометрия матки увеличивается [5]. Своевременная коррекция выявленных нарушений, которая базируется на определении функциональной активности эндокринной системы на молекулярно-клеточном уровне, открывает новые перспективы для диагностики и коррекции нарушений системы репродукции в разные возрастные периоды. Для идентификации нормального и патологического функционирования эндометрия у женщин разного возраста необходимо изучение изменения гормональной активности, экспрессии молекул апоптоза и пролиферации [15]. В связи с этим целью работы явилось изучение функциональной активности эндометрия и выявление наиболее значимых маркеров возрастных особенностей эндометрия у женщин разного возраста. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Эндометриальная ткань была получена из матки женщин на 13-й день менструального цикла при профилактическом обследовании в НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАН. В соответствии с классификацией ВОЗ женщины были разделены на 3 группы: молодого (22–35 лет), среднего (45–55 лет) и пожилого возраста (60–74 года). Возрастная группа 36–44 года была нами исключена из рассмотрения, поскольку старение репродуктивной системы у женщин имеет значительные индивидуальные особенности, которые наиболее выражены именно в этом периоде. Для получения клеточной суспензии ткань эндометрия измельчали на фрагменты размером 1 мм и подвергали ферментативной обработке 0,1% раствором коллагеназы 1-го типа (Gibco). Время инкубации ткани составило 20–30 мин при комнатной температуре. Затем действие фермента нейтрализовали добавлением питательной среды DMEM/F12 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, после чего суспензию центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Полученный осадок ресуспензировали в ростовой среде DMEM/F12 с 15% эмбриональной телячьей сывороткой. Далее суспензию эндометриальных клеток переносили в культуральные флаконы площадью 25 см2 (Биолот). Посевная концентрация составляла 1 млн клеток на 1 см2. В течение первых 3 дней каждые 24 ч проводили смену среды. Культивирование эндометриальных клеток человека проводили во всех случаях в идентичных условиях, в среде DMEM/F12 c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицина (50 мкг/мл). Клетки культивировали в стандартных условиях при 37°С и 5% СО2. Смену среды проводили каждые 2–3 дня. По достижении клетками 80% конфлюентного монослоя их рассевали с концентрацией 150–200 клеток на 1 см2. Пересев проводили с помощью 0,25% раствора трипсина с ЭДТА. Клетки выращивали до 3-го пассажа. Для определения экспрессии сигнальных молекул культивируемые эндометриальные клетки были посеяны на чашки Петри. Клетки дважды промывали в фосфатно-солевом буфере (pH 7,5) в течение 5 мин, затем фиксировали 96% этиловым спиртом, охлажденным до -20°С. Блокада эндогенной пероксидазы проводилась следующим образом. Чашки Петри с культурами заливали 2 мл 3% водного раствора перекиси водорода на 15 мин, а затем дважды промывали в фосфатно-солевом буфере (pH 7,5) по 5 мин. Далее образцы инкубировали с первичными (специфичными) антителами. В качестве первичных антител были взяты моноклональные мышиные антитела к рецепторам эстрогена (ER) (Dako, 1:30) и прогестерона (PR) (Novocastra, 1:50), Fas-L (Dako, 1:100), p53 (Dako, 1:50), Caspase-3 (Novocastra, 1:150), CD34 (Dako, 1:75), Ki67 (Dako, 1:50). Инкубацию со всеми антителами проводили при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем следовали промывка в 2 сменах фосфатно-солевого буфера по 5 мин и инкубирование 30 мин со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (EnVision Detection System, Peroxidase/DAB, Rabbit, Mouse). В качестве вторичных антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные антимышиные иммуноглобулины (EnVision the endometrium with age decreased in 1,5-2 times. Thus the expression of the marker of the immune response Fas-L in the endometrium with age was almost unchanged. As change in synthesis of ER, PR, Fas-L, and Caspase-3, CD34, Ki67, p53 plays an important role in the development of the endometrium pathology (endometriosis, hyperplasia, endometrial cancer, infertility) they can be used for preventive diagnosis of aging and the pathology of the female reproductive system. Conclusion. These data offer new perspectives for molecular diagnostics of aging processes and pathology of the endometrium in the cell culture obtained from the biopsy material.
Keywords: 
endometrium, aging, signaling molecules, pathology

Список литературы: 
  1. Avtandilov G.G. Morfometriya v patologii. Rukovodstvo dlya vrachey. M.: Medicina, 1973; 248 s. [Avtandilov G.G. Morphometry in pathology. Manual for Physicians. M: Medicine, 1973; 248 p. (in Russian)]
  2. Aylamazyan E`.K., Petrosyan M.A., Tolibova G.H., Krylova T.A., Goryachaya T.S., Petrova L.I., Durnova A.O., Polyakova V.O., Kvetnoy I.M. Kul`tura e`ndometriya cheloveka: model` izucheniya reproduktivnoy funkcii. Fundamental`naya medicina, Medicinskiy Akademicheskiy zhurnal. 2012; 12–1: 28–35. [Ailamazyan E.K., Petrosyan M.A., Tolibova G.H., Krylova T.A., Goryachaya T.S., Petrova L.I., Durnova A.O., Polyakova V.O., Kvetnoy I.M. Culture of human endometrium – model for studying reproductive function. Fundamental Medicine, Academic Medical Journal. 2012; 12–1: 28–35 (in Russian)]
  3. Kovyazin V.A. Immunogistohimicheskoe issledovanie proliferativnyh, giperplasticheskih i neoplasticheskih processov v e`ndometrii. Avtoref. dis…. kand. med. nauk. M.: 2005; 19 s. [Kovyazin V.A. Immunohistochemical study of proliferative, hyperplastic and neoplastic processes in the endometrium. Abstract dissertation PhD. Moscow. 2005; 19 p. (in Russian)]
  4. Lysenko O.N., Ashhab M.H., Strizhova N.V., Babichenko I.I. Immunogistohimicheskie issledovaniya e`kspressii receptorov k steroidnym gormonam pri giperplasticheskih processah v e`ndometrii. Arhiv patologii. 2004; 66 (2): 7–10. [Lisenko O.N., Ashhab M.H., Strizhova N.B., Babichenko I.I. Immunohistochemical study of the expression of receptors for steroid hormones in hyperplastic processes in the endometrium. Archives of Pathology. 2004; 66 (2): 7–10 (in Russian)]
  5. Mahina E.V., Pichigina A.K., Koldysheva E.V., Molodyh O.P., Lushnikova E.L. Diagnosticheskaya i prognosticheskaya znachimost` ocenki proliferativnoy aktivnosti kletochnyh populyaciy e`ndometriya pri giperplasticheskih i neoplasticheskih processah. Fundamental`nye issledovaniya. 2014; 10–2: 420–7. [Mahina E.V., Pichigina A.K., Koldisheva E.V., Molodih O.P., Lushnikova E.L. Diagnostic and prognostic value of assessing of the proliferative activity of endometrial cell populations at hyperplastic and neoplastic processes. Fundamental researches. 2014; 10–2: 420–7 (in Russian)]
  6. Pal`cev M.A., Kvetnoy I.M. Rukovodstvo po neyroimmunoe`ndokrinologii. M.: Shiko, 3-e izd., 2014; 756 c. [Paltsev M.A., Kvetnoy I.M. The application of neuro-immuno-endocrinology. Moscow, Russia. Shiko, the 3rd ed., 2014; 756 p. (in Russian)]
  7. Pal`cev M.A., Kvetnoy I.M., Polyakova V.O., Gurko G.I., Mursalov S.U. Neyroimmunoe`ndokrinnye mehanizmy stareniya i vozrastnoy patologii. SPb.: Nauka, 2012; 463 c. [Paltsev M.A., Kvetnoy I.M., Ployakova V.O., Gurko G.I., Mursalov S.U. Neuro-immuno-endocronology mechanisms of aging and age-related diseases. St. Perersburg, Russia: Nauka, 2012. – 463 p. (in Russian)]
  8. Porubova Ya.P. Immunogistohimicheskoe issledovanie e`ndometriya kak metod monitoringa v programmah podgotovki e`ndometriya u zhenshhin s neudachami vspomogatel`nyh reproduktivnyh tehnologiy v anamneze. Ya.P. Porubova, T.Yu. Pestrikova. Molodoy uchenyy. 2014; 6: 322–7.
  9. Achache N., Revel A. Endometrial receptivity markers, the journey to successful embryo implantation. Hum Reprod Update. 2006; 12 (6): 731–46.
  10. Deligdisch L. Hormonal pathology of the endometrium. Mol. Pathol. 2000; 13 (3): 285–94.
  11. Khan M.S., Dodson A.R., Heatley M.K. Ki-67, estrogen receptor, and progesterone receptor proteins in the human rete ovarii and in endometriosis. J. Clin. Pathol. 1999; 52: 517–20.
  12. Mitselou A., Ioachin E., Vougiouklakis T. Immunohistochemical study of apoptosis-related Bcl-2 protein and its correlation with proliferation indices (Ki67, PCNA), tumor suppressor genes (p53, pRb), the oncogene c-erbB-2, sex steroid hormone receptors and other clinicopathological features, in normal, hyperplastic and neoplastic endometrium. In Vivo. 2003; 17 (5): 469–77.
  13. Satoshi Oizumi, Koichi Yamazaki, Manabu Nakashima, Takeshi Watanabe, Fumihiro Hommura, Shigeaki Ogura, Masaharu Nishimura, Hirotoshi Dosaka-Akita. Association between RCAS1 expression and clinical outcome in uterine endometrial cancer. British Journal of Cancer (Impact Factor: 4.82). 2003; 89 (3): 546–51.
  14. Sidonia C.S., Cristiana S., Cl M., Stepan A., Nurciu M. Endometrial carcinomas: correlation between ER, PR, Ki67 status and histopathological prognostic parameters. Romanian journal of morphology and embryology = Revue roumaine de morphologie et embryologie. 2011; 52 (2): 631–6.
  15. Taylor L.J., Jackson T.L., Reid J.G., Duffy S.R. The- differential expression of estrogen receptors, progesterone receptors, Bcl-2 and Ki67 in endometrial polyps. BJOG. 2003; 110 (9): 794–8.
  16. Yanaihara A., Yorimitsu T., Motoyama H., Iwasaki S., Kawamura T. Location of endometrial polyp and pregnancy rate in infertility patients. Fertil Steril. 2008; 90 (1): 180–2.