РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОМОЕВОЙ КИСЛОТЫ В МОРЕПРОДУКТАХ

DOI: https://doi.org/None

Н.В. Кочкина (1), П.М. Шалимов (1), доктор медицинских наук, профессор, А.В. Малинин (1), кандидат медицинских наук, доцент, В.В. Врублевская (2), кандидат биологических наук, О.С. Моренков (2), доктор биологических наук 1 -Научный центр «Сигнал», Российская Федерация, 107014, Москва, ул. Большая Оленья, д. 8; 2 -Институт биофизики клетки РАН, Российская Федерация, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, д. 3 E-mail:[email protected]

Введение. Амнестическое отравление моллюсками (Amnesic Shellfish Poisoning) вызывается при потреблении морепродуктов, контаминированных домоевой кислотой (ДК) и сопровождается желудочными коликами, тошнотой, судорогами, галлюцинациями, потерей ориентации и памяти (амнезией). Директивой Евросоюза 2002/226/ЕС и СанПиН 2.3.2.2401-08 в качестве профилактики данных отравлений регламентируется обязательная проверка морепродуктов на наличие ДК. Иммуноферментный анализ (ИФА) является одним из наиболее перспективных методов выявления ДК, сочетающим высокую чувствительность, специфичность, простоту и скорость выполнения анализа. В России отсутствует ИФА для определения ДК отечественного производства. Цель исследования. Разработать чувствительный и специфичный ИФА для качественного обнаружения и количественного определения ДК в морепродуктах. Результаты. Разработан прямой конкурентный ИФА на основе полученных ДК-специфических поликлональных антител для определения ДК. Пороговая концентрация токсина, выявляемая с помощью разработанного ИФА, составила 0,05– 0,07 нг/мл, 50% ингибирующая концентрация – 0,7–1,0 нг/мл, диапазон количественного определения – 0,1–5,0 нг/мл пробы. Разработанный ИФА позволял достоверно выявлять токсин в образцах тканей моллюсков при его содержании от 5 нг/г, что в 4000 раз ниже предельно допустимого значения для ДК (20 мкг/г). Заключение. Разработанный ИФА может быть использован для мониторинга контаминации морепродуктов ДК с целью профилактики амнестического отравления моллюсками.
Ключевые слова: 
амнестическое отравление моллюсками, домоевая кислота, иммуноферментный анализ
Для цитирования: 
Кочкина Н.В., Шалимов П.М., Малинин А.В., Врублевская В.В., Моренков О.С. РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОМОЕВОЙ КИСЛОТЫ В МОРЕПРОДУКТАХ. Молекулярная медицина, 2015; (3): -
Список литературы: 
  1. Hallegraeff G.M. Manual on Harmful Algal Blooms.UNESCO press; 1995.
  2. Tammilehto A., Nielsen T.G., KrocketB., Møller E.F., Lundholm N. Calanus spp. Vectors for the biotoxin, domoic acid, in the Arctic marine ecosystem? Harmful Algae.2012; 20: 165–74.
  3. Todd E.C.D.Domoic Acid and Amnesic Shellfish Poisoning – A Review.J. Food Protection. 1993; 56 (1): 69–83.
  4. Lundholm N., Skov J., Pocklington R., Moestrup O. Domoic acid, the toxic amino acid responsible for amnesic shellfish poisoning, now in Pseudonitzschiaserata (Bacillariophyceae) in Europe. Phycologia. 1994; 33 (6): 475–8.
  5. Douglas D.J., Bates S.S. Production of domoic acid, a neurotoxic amino acid, by an axenic culture of the marine diatom Nitzschiapungens f. multiseries, Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1992; 49 (1): 85–90.
  6. Wright J.L.C. Dealing with seafood toxins: present approaches and future options. Food Research International. 1995; 28 (4): 347–58.
  7. Skov J., Lundholm N., Moestrup O., Larsen J. Potentially toxic phytoplankton. 4. The diatom genus Pseudo-nitzschia (Diatomophyceae/Bacillariophyceae). ICES Identification Leaflets for Phytoplankton. ICES: Copenhagen. Denmark. 1999; 1–23.
  8. Hungerford J.M., Wekell M.M. Analytical methods for marine toxins,Food Poisoning – Handbook of Natural Toxins. 1992; 7: 441–50.
  9. Pleasance S., Thibault S., Kelly J. Comparison of liquid-junction and coaxial interfaces for capillary electrophoresis-mass spectrometry with application to compounds of concern to the acquaculture industry.Chromatogr.1992; 591: 325–9.
  10. Smith D.S., Kitts D.D. Enzyme Immunoassay for the Determination of Domoic Acid in Mussel Extracts. J. Agric. Food. Chem. 1995; 43: 367–71.
  11. 11. Zhuo L., YinY.,FuW. Determination of paralytic shellfish poisoning toxins by HILIC–MS/MS coupled with dispersive solid phase extraction.Food Chemistry.2013; 137: 115–21.
  12. Smith D.S., Kitts D.D. Enzyme Immunoassay for the Determination of Domoic Acid in Mussel Extracts, J. Agric. Food. Chem. 1995; 43: 367–71.
  13. Volterra L., Bruno M., Gucci P.M.B., Pierdominici E. Fast method for detecting toxic cyanophyte blooms, Environ. Toxicol. Water Qual. 1992; 7: 215–22.
  14. Ross K.M., Miles C.O., Hansen R.P. Polyclonal antibodies to domoic acid and their use in immunoassays for domoic acid in seawater and shellfish.Hansen Nat. Toxins.1998; 6: 93–104.
  15. Dubois M., Demoulin L., Charlier C. Development of ELISAs for detecting domoic acid, okadaic acid, and saxitoxin and their applicability for the detection of marine toxins in samples collected in Belgium. Food AdditContam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 2010;27(6): 859–68.
  16. Yu F.Y., Liu B.H., Wu T.S. Development of a sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of domoic Acid in shellfish. J.Agric Food Chem. 2004; 25;52(17): 5334–39.
  17. Garthwaite I., Ross K.M., Miles C.O. Polyclonal antibodies to domoic acid, and their use in immunoassays for domoic acid in sea water and shellfish. Nat Toxins. 1998; 6(3–4): 93–104.
  18. Andjelkovic M.,Vandevijvere S., Van Klaverenetatal J. Exposure to domoic acid through shellfish consumption in Belgium. Environment International. 2012; 49: 115–9.
  19. Wang Q., Cheng J.P., Gao L.L. Development of direct competitive enzyme-linked immunosorbent assayfor the determination of domoic acid.Huan Jing KeXue. 2012; 33(2): 647–51.
  20. Liu R., Xu D., Dong Y., Liang Y.A indirect competitive ELISA to detect domoic acid in seawater and shellfish. Wei Sheng Yan Jiu. 2009; 38(5): 622–4.
  21. Kleivdal H.,Kristiansen S.I., Nilsen M.V. Determination of domoic acid toxins in shellfish by biosense ASP ELISA--a direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay: collaborative study. J. AOAC Int. 2007;90(4): 1011–27.
  22. Kleivdal H., Kristiansen S.I., Nilsen M.V., Briggs L. Single-laboratory validation of the biosense direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for determination of domoic acid toxins in shellfish. J. AOAC Int. 2007; 90(4): 1000–10.
  23. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265–75.
  24. Matsuura S., Hamano Y., Kita H., Takagaki Y. Preparation of mouse monoclonal antibodies to okadaic acid and their binding activity in organic solvents. J. Biochem. 1993; 114(2): 273–8.
  25. Volterra L., Bruno M., Gucci P.M.B., Pierdominici E. Fast method for detecting toxic cyanophyte blooms, Environ. Toxicol. Water Qual. 1992; 7: 215–22.
  26. Petersand J.P., Baumgarten H. Monoclonal antibodies. Springer-Verlag: Berlin Heidelberg.1992: 271–5.
  27. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature. 1970; 227: 680–5.
  28. Knapp W., Holubar K., Wick G. Immunofluorescence and related staining techniques: North Holland. Amsterdam: Elsevier. 1978: 215–24