A COMPARATIVE IMMUNOCYTOCHEMICAL ANALYSIS OF DNA METHYLATION PATTERNS IN HUMAN METAPHASE CHROMOSOMES OF ADULTS AND FETUSES

DOI: https://doi.org/None

O.A. Efimova (1–3), A.A. Pendina (1–3), A.V. Tikhonov (1–3), O.G. Chiryaeva (1), L.I. Petrova (1), V.S. Dudkina (1,3), N.A. Sadik (1,3), T.V. Kuznetzova (1–3), V.S. Baranov (1,2) 1 -D.O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, St. Petersburg, Mendeleevskaya line, 3, Russian Federation, 199034; 2 -St. Petersburg State University, St. Petersburg, Universitetskaya nab. 7/9, Russian Federation, 199034; 3 -Center for Medical Genetics, St. Petersburg, Tobolskaya, 5, Russian Federation, 194044

Introduction. DNA methylation is a key epigenetic modification providing the regulation of human genome activity in ontogenesis. DNA methylation patterns were described in the chromosomes from adult lymphocytes. DNA methylation patterns of the chromosomes from the embryonic cells have not been studied so far. The aim of the study. A comparative study of DNA methylation patterns in human metaphase chromosomes from the lymphocytes of adults and fetuses. Methods. The immunocytochemical detection of 5-methylcytosine in the QFH/AcD-banded metaphase chromosomes from PHAstimulated lymphocytes of fetuses at 20–24 weeks of gestation. Сравнительный иммуноцитохимический анализ профилей метилирования ДНК... 18 №3, 2015 Молеккуулярная медицина ВВЕДЕНИЕ Значимой эпигенетической модификацией генома человека является метилирование ДНК – присоединение метильной группы к 5-му положению цитозина в составе динуклеотида 5'-CpG-3'. Доказано участие метилирования в регуляции экспрессии импринтированных генов, тканеспецифичных генов и большинства генов «домашнего хозяйства» [1–6]. CрG-динуклеотиды распределены в геноме неравномерно и обнаруживают определенную специфичность. Последняя коррелирует с поперечной исчерченностью метафазных хромосом, получаемой с помощью методов дифференциальной окраски. Для изучения профилей метилирования ДНК метафазных хромосом разработаны подходы, позволяющие прямо или косвенно определить характер распределения метилированных остатков цитозина. К таким подходам относятся обработка митотических хромосом метилчувствительными эндонуклеазами рестрикции, ник-трансляция in situ с предварительной обработкой метилспецифичными рестриктазами [7], PRINS и SPRINS [8]. Наиболее перспективным является метод иммуноцитохимической детекции 5-метилцитозина с помощью высокоспецифичных моноклональных антител. Использование антител – сравнительно простая методика, позволяющая получать хорошо воспроизводимые результаты, в том числе при работе с ограниченным количеством биологического материала [9–12]. Наличие флюоресцентных сигналов, наблюдаемых после иммунофлюоресцентного окрашивания, позволяет выявить участки хроматина, обогащенные 5-метилцитозином. Распределение 5-метилцитозина по длине метафазных хромосом детально изучено иммуноцитохимическим методом в лимфоцитах периферической крови индивидов с нормальным кариотипом [11, 13–15]. В то же время представляет несомненный интерес установить, в какой мере этот рисунок характерен для метафазных хромосом из клеток других тканей, особенно эмбриональных. Именно аномалии метилирования могут приводить к нарушениям эмбрионального развития и становиться причиной различных патологических состояний. Лимфоциты крови плода являются удобной и доступной моделью для цитогенетического исследования метилирования ДНК в пренатальном периоде развития человека. Целью исследования было сравнительное изучение особенностей метилирования метафазных хромосом из лимфоцитов периферической крови взрослых и пуповинной крови плодов человека. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Материалом для исследования служили препараты метафазных хромосом ФГА-стимулированных лимфоцитов пуповинной крови 3 плодов человека мужского и 2 – женского пола при сроке гестации 20–24 нед. Образцы пуповинной крови были получены методом кордоцентеза в ФГБУ НИИ АГ им. Д.О. Отта СЗО РАН в связи с необходимостью пренатального кариотипирования. Культивирование лимфоцитов, приготовление препаратов метафазных хромосом и их окрашивание флюорохромом Хехст 33258 с последующим контрастированием актиномицином D (QFH/AcD) осуществляли по стандартной методике с собственными модификациями [16]. У всех плодов был установлен нормальный кариотип. Участки хромосом, обогащенные 5-метилцитозином, выявляли иммуноцитохимическим методом с помощью моноклональных антител (Eurogentec, Бельгия) на QFH/AcD-окрашенных метафазных хромосомах согласно описанной методике [11, 17] при уровне разрешения ~400 сегментов (ISCN, 2013). Препараты анализировали c помощью микроскопа Leica DM LS, оборудованного объективами Fluotar 20×/0,40 и 100×/1,30–0,60, автоматической фотонасадкой, цветной камерой Leica DFC 320, блоком светофильтров. Для получения фотооизображения использовали программное обеспечение Leica DFC Twain. Распределение и интенсивность иммунофлюоресцентного сигнала оценивали визуально полуколичественным методом и с помощью программного обеспечения Image J 1.34s. Всего проанализировано 49 метафазных пластинок. Для визуальной оценки различий интенсивности иммунофлюоресцентного сигнала использована разработанная ранее балльная система [11], в которой яркость свечения оценивали визуально по 5-балльной шкале (0 – отсутствие сигнала, 1 – очень слабый сигнал, 2 – слабый сигнал, 3 – сигнал средней интенсивности, 4 – сильный сигнал). Анализировали отдельно каждую хромосому из разных метафазных пластинок. На основе визуальной оценки уровня иммунофлюоресценции, каждому сегменту в гомоResults. Both in the adults and in the fetuses R- and T-bands, pericentromeric heterochromatin of chromosomes 1, 9 and 16 and short arms of acrocentric chromosomes had the high levels of DNA methylation. When comparing the adult and the fetal chromosomes, different levels of 5-methylcytosine were revealed in the several bands. The higher levels of DNA methylation in the fetuses were found in bands 2q23, 2q31, 2q33, 5q13, 6p11.2, 7p13, 7p15, 13q22, 14q13 in contrast to bands 1q42, 3q21, 3q25, 12p13, 12q13, 15q11.2-13, 15q15, 16q22, 17q21, 18q11.2, 20q11.2, 21q11.2, 22q11.2, demonstrating lower DNA methylation. Conclusion. The immunocytochemical detection of 5-methylcytosine reveals a specific banding pattern in the metaphase chromosomes from the adult and the fetal lymphocytes. The difference between the fetal and the adult DNA methylation level in several bands favors that this banding pattern is linked both to chromatin structure and function.
Keywords: 
DNA methylation, metaphase chromosomes, immunocytochemical analysis, lymphocytes, human fetus
Список литературы: 
  1. Bestor T.H. The host defence function of genomic methylation patterns, Novartis Found Symp. 1998; 214: 187–95.
  2. Pendina A.A., Efimova O.A., Kuznecova T.V., Baranov V.S. Bolezni genomnogo imprintinga. Zhurnal akusherstva i zhenskih bolezney. 2007; LVI (1): 73–80. [Pendina A.A., Efimova O.A., Kuznetzova T.V., Baranov V.S. Genomic Imprinting Diseases. J. of obstetrics and women’s diseases. 2007; LVI (1): 73–80 (in Russian)]
  3. Efimova O.A., Pendina A.A., Tihonov A.V., Kuznecova T.V., Baranov V.S. Metilirovanie DNK – osnovnoy mehanizm reprogrammirovaniya i regulyacii genoma cheloveka. Medicinskaya genetika. 2012; 4 (118): 10–8. [Efimova O.A., Pendina A.A., Tikhonov A.V., Kuznetzova T.V., Baranov V.S. DNA methylation – a major mechanism of human genome reprogramming and regulation. Medical Genetics. 2012; 4 (118): 10–8 (in Russian)]
  4. Skaar D.A., Li Y., Bernal A.J., Hoyo C., Murphy S.K., Jirtle R.L. The human imprintome: regulatory mechanisms, methods of ascertainment, and roles in disease susceptibility. ILAR J. 2012; 53 (3–4): 341–58.
  5. Buck-Koehntop B.A., Defossez P.A. On how mammalian transcription factors recognize methylated DNA. Epigenetics. 2013; 8 (2): 131–7.
  6. Cheedipudi S., Genolet O., Dobreva G. Epigenetic inheritance of cell fates during embryonic development. Front. Genet. 2014; 5: 19.
  7. Adolph S., Hameister H. In situ nick translation of human metaphase chromosomes with the restriction enzymes MspI and HpaII reveals an R-band pattern, Cytogenet. Cell Genet. 1990; 54 (3–4): 132–6.
  8. Andersen C.L., Koch J., Kjeldsen E. CpG islands detected by self-primed in situ labeling (SPRINS). Chromosoma. 1998; 107: 260–6.
  9. Santos F., Dean W. Epigenetic reprogramming during early development in mammals. Reproduction. 2004; 127: 643–51.
  10. Baranov V.S., Pendina A.A., Kuznecova T.V. i dr. Nekotorye osobennosti statusa metilirovaniya metafaznyh hromosom u zarodyshey cheloveka doimplantacionnyh stadiy razvitiya. Citologiya. 2005; 47 (8): 723–30. [Baranov V.S., Pendina A.A., Kuznetsova T.V., Efimova O.A., Fedorova I.D., Leont’eva O.A., Korsak V.S., Nikol’skiĭ N.N. Peculiarities of metaphase chromosome methylation pattern in preimplantation human embryos. Tsitologiia. 2005; 47 (8): 723–30 (in Russian)]
  11. Pendina A.A., Efimova O.A., Kaminskaya A.N., Kuznecova T.V., Baranov V.S. Immunocitohimicheskiy analiz statusa metilirovaniya metafaznyh hromosom cheloveka. Citologiya. 2005; 47 (8): 731–7. [Pendina A.A., Efimova O.A., Kaminskaia A.N., Kuznetsova T.V., Baranov V.S. Immunocytochemical analysis of human metaphase chromosome methylation status, Tsitologiia. 2005; 47 (8): 731–7 (in Russian)]
  12. Pendina A.A., Efimova O.A., Fedorova I.D., Leont’eva O.A., Shilnikova E.M., Lezhnina J.G., Kuznetzova T.V., Baranov V.S. DNA methylation patterns of metaphase chromosomes in human preimplantation embryos. Cytogenet Genome Res. 2011; 132 (1–2): 1–7.
  13. Barbin A., Montpellier C., Kokalj-Vokac N., Gibaud A., Niveleau A., Malfoy B., Dutrillaux B., Bourgeois C.A. New sites of methylcytosine-rich DNA detected on metaphase chromosomes. Hum. Genet. 1994; 94 (6): 684–92.
  14. Montpellier C., Burgeois C.A., Kokalj-Vokac N., Muleris M., Niveleau A., Reynaud C., Gibaud A., Malfoy B., Dutrillaux B. Detection of methylcytosine-rich heterochromatin on banded chromosomes. Application to cells with various status of DNA methylation, Cancer Genet. Cytogenet. 1994; 78 (1): 87–93.
  15. Pfarr W., Webersinke G., Paar C., Wechselberger C. Immunodetection of 5’-methylcytosine on Giemsa-stained chromosomes, BioTechniques. 2005; 38 (4): 527–30.
  16. Kuznecova T.V., Loginova Yu.A., Chiryaeva O.G., Pendina A.A., Efimova O.A., Fedorova I.D., Baranov V.S. Medicinskie laboratornye tehnologii: rukovodstvo po klinicheskoy laboratornoy diagnostike. M.: GE`OTAR-Media, 2013; 623–57. [Kuznetsova T.V., Loginova J.A., Chiryaeva O.G., Pendina A.A., Efimova O.A., Fedorova I.D., Baranov V.S. Medical laboratory technology: a guide for clinical laboratory diagnostics. M.: GEOTAR-Media, 2013; 623–57 (in Russian)]
  17. Verma R.S., Babu A. Human Chromosomes: Manual of Basic Techniques. N-Y: Pergamon Press. Inc. 1989.
  18. Saccone S., Bernardi G. Human chromosomal banding by in situ hybridization of isochors. Methods in Cell Science. 2001; 23: 7–15.
  19. Zoubak S., Clay O., Bernardi G. The gene distribution of the human genome. Gene. 1996; 174: 95–102.
  20. Calloni R., Cordero E.A., Henriques J.A., Bonatto D. Reviewing and updating the major molecular markers for stem cells. Stem Cells Dev. 2013; 22 (9): 1455–76.