EXPRESSION OF AORTA ENDOTHELIUM SIGNALING MOLECULES IN AGEING AND ATHEROSCLEROSIS

Introduction. Atherosclerosis proves to be age-dependent and social significant pathology. Knowledge of the role of signaling molecules in its development, and the elaboration on this basis molecular markers of restenosis after stenting of arteries remains to be insufficient. The goal of this work is the comparative analysis of signaling molecules during endothelium ageing in normal and atherosclerosis cells for elaboration of the methodological base for molecular markers of restenosis. Methods. There were used as well the method of primary dissociate cell cultures, as immunohistochemistry, immunocytochemistry and morphometry. The study was performed in human autopsy aorta material from people of the various age and in endothelial cell cultures. To study of cellular aging there were used «ageing» cultures of atherosclerotic endothelium (7th passage) and normal human endothelial cultures (14th passage). Экспрессия сигнальных молекул в эндотелии аорты при старении и атеросклерозе Молеккуулярная медицина №5, 2015 13 ВВЕДЕНИЕ Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), связанные с атеросклерозом, – основная причина заболеваемости, инвалидности и смерти в развитых странах. Согласно оценкам ВОЗ, в ближайшее десятилетие ССЗ угрожают стать основной причиной смерти в развивающихся странах [1]. При этом пожилой возраст остается одним из основных факторов риска развития ССЗ [2]. Вопросы нейроиммуноэндокринной регуляции, в частности, данные о сигнальных молекулах эндотелия, участвующих в механизмах развития возрастассоциированной патологии, являются ключевым аспектом в понимании причин развития эндотелиальной дисфункции и старения сердечно-сосудистой системы (ССС) [3, 4]. В литературе описаны некоторые нейрогуморальные маркеры (ренин, эндотелин-1, натрийуретические пептиды, цитокины), определение которых может быть использовано для уточнения риска и прогноза возрастассоциированной патологии ССС [5–7]. Нами проведен сравнительный анализ экспрессии сигнальных молекул при старении эндотелия в норме и при атеросклерозе. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Объектом для исследования служили аутопсийный материал аорты людей разного возраста без ССЗ и первичные культуры эндотелия аорты человека в норме и при атеросклерозе. Аутопсийный материал аорты был получен в ГБУЗ «Городская больница святого великомученика Георгия» (Санкт-Петербург) и разделен на возрастные группы: 1-я – молодой и средний возраст (35,4±3,4 года; n=30), 2-я – пожилой возраст (72,3±4,2 года; n=25), 3-я – старческий возраст (83,4±4,1 года; n=25), 4-я – долгожители (93,5±3,1 года; n=15). Для создания культур клеток материал аорты без патологических изменений был получен от эмбриона человека (21 нед гестации) в НИИ акушерства и гинекологии им Д.О. Отта РАН (Санкт-Петербург). Ткань атеросклеротической аорты человека (диаметром 0,2 см, 4 фрагмента) была получена при операции аортокоронарного шунтирования у лиц пожилого возраста, проводившейся в клинике сердечно-сосудистой хирургии ВМА им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург). Культуры эндотелиоцитов выращивали в среде, содержащей 87,5% M199, 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1,5% НЕРЕS, 1% PES, L-глутамин. Выделение первичной культуры проводили на чашках Петри (Sarstedt), обработанных раствором фибриногена (Gibco), последующее культивирование осуществлялось во флаконах с обработанной поверхностью объемом 50 мл (Sarstedt 25 см2). Пассирование производили через 3 дня на 4-й, когда культура достигала состояния монослоя. Клетки культивировали до 7-го пассажа для эндотелия, пораженного атеросклерозом и до 14-го пассажа – для нормального эндотелия, на котором клетки были рассеяны на планшет. Клетки нормального эмбрионального эндотелия 14-го пассажа соответствуют «старым» культурам в соответствии с рекомендацией Международной ассоциации исследований клеточных культур (СанФранциско, США, 2007). Экспериментально было установлено, что клетки эндотелия, пораженного атеросклерозом, полученные от лиц пожилого возраста, могут пройти не более 7 пассажей, далее культура гибнет. В связи с этим в данном случае за «старые» культуры атеросклеротического эндотелия принимали клетки 7-го пассажа. Иммуногистохимическое исследование аутопсийного материала и иммуноцитохимическое исследование культур клеток проводили с применением мышиных моноклональных антител к маркерам ICAM-1 (Abcam, 1:100), Ki-67 (Dako, 1:75), Р53 (Dako, 1:50), Р-селектин (Abcam, 1:150), VEGF (Dako, 1:100), Cx37 (Dako, 1:100). Для выявления мышиных иммуноглобулинов использовали универсальный биотин-стрептавидин-пероксидазный набор (MP Biomedicals). Субстратный фермент проявляли диаминобензидином (Liquid DAB+ Substrate Chromogen System, Dako). Маркеры клеточной адгезии (ICAM-1 и Р-селектин) были выбраны для изучения корреляции возрастной инволюции эндотелия и развития атеросклероза, так как известно, что с возрастом в областях с высокой степенью полиплоидии эндотелиальных клеток существенно возрастают адгезивные свойства эндотелия, что может обусловить локальность межклеточных взаимодействий (лейкоциты – эндотелий) и способствовать развитию атеросклеротических поражений в этих зонах [8, 9]. Маркеры клеточного обновления Ki67, Р53 [10] и протеины VEGF, Cx37 [11] изучали с целью выявления возможного смещения баланса процессов клеточного обновления в сторону повышения апоптоза и нарушения межклеточных контактов. Results. In the study on the autopsy human aorta material, expression of signal molecules, involved in cell renovation, adhesion and intracellular interaction, was shown to be changed by 1,5–3 times throughout ageing. In endothelial atherosclerotic cultures ICAM-1, Р-selectin, VEGF, P53, Ki67, Cx37 expression was shown to be changed by 3–6 times in comparison with normal ageing endothelial cultures. Conclusion. Molecular mechanisms of vessel endothelium ageing and development of atherosclerosis in the endotheliocytes culture and process of normal endothelium ageing in the human body are characterizeв the similar pattern of the change of expression of signaling molecules, however these changes in atherosclerosis are pronounced more dramatically.