ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕЧЕННЫХ 125I ТАРГЕТНЫХ МОЛЕКУЛ DARPIN9_29 ДЛЯ РАДИОНУКЛИДНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ С ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ HER2/NEU

DOI: https://doi.org/10.29296/24999490-2018-06-07

О.Д. Брагина(1), кандидат медицинских наук, А.Г. Воробьева(5), кандидат химических наук, В.М. Толмачев(5), доктор химических наук, профессор, А.М. Орлова(5), доктор химических наук, профессор, В.И. Чернов(1, 2), доктор медицинских наук, профессор, С.М. Деев(2, 4), доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН, Г.Н. Прошкина(4), кандидат биологических наук, А.А. Шульга(4), кандидат биологических наук, М.С. Ларькина(3), кандидат фармацевтических наук, Р.В. Зельчан(1), кандидат медицинских наук, И.Г. Синилкин(1), кандидат медицинских наук, А.А. Медведева(1), кандидат медицинских наук 1-НИИ онкологии ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН», Российская Федерация, 634009, Томск, пер. Кооперативный, 5; 2-ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет», Российская Федерация, 634050, Томск, проспект Ленина, 30; 3-ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Российская Федерация, 634055, Томск, Московский тракт, 2; 4-ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, Российская Федерация, 117997, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; 5-Уппсальский университет, Швеция, Уппсала, Segerstedthuset, Dag Hammarskjölds väg 7 E-mail: rungis@mail.ru

Введение. Одной из наиболее изучаемых в настоящее время молекулярных мишеней является рецептор эпидермального фактора роста Her2/neu, гиперэкспрессия которого ассоциируется с плохим прогнозом и агрессивным течением злокачественных опухолей. Использование неинвазивных радионуклидных методов с применением высокоаффинных направленных молекул приобретает все бо́льшую популярность среди методов молекулярной визуализации. В последние годы активно изучается новый класс связывающих белков, получивший название «альтернативные каркасные белки», одним из представителей которого являются DARPin (Design Ankyrin Repeat Protein), отвечающие всем необходимым требованиям для создания эффективного радиохимического соединения. Цель исследования. Изучение эффективности радиохимического соединения на основе меченных 125I таргетных молекул DARPin9_29 для радионуклидной диагностики злокачественных опухолей с гиперэкспрессией Her2/neu. Материал и методы. Для получения молекулы использовали модифицированную генетическую конструкцию с последовательностью, кодирующей рекомбинантные адресные молекулы DARPin9_29. Мечение выполняли по стандартной методике, радиохимические выход и чистоту определяли с использованием тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ), очищение проводили с помощью очищающих колонок NAP-5 (GE Healthcare). Тест на стабильность выполняли с помощью инкубации меченого протеина в растворе PBS (натрий-фосфатный буфер) при комнатной температуре в течение 1 и 3 ч, анализ выполняли с применением ТСРХ. В исследованиях in vitro использовались 3 клеточные линии с различной экспрессией Her2/neu: SKOV-3, BT474 и DU145. Специфичность соединения определяли путем блокирования рецепторов. Для исследований in vivo использовались клетки SKOV-3, вводимые подкожно в правую заднюю конечность самкам мышей BALB/c nu/nu. У всех мышей изучали биораспределение препарата и визуализацию опухолевого узла через 6 ч после инъекции. Результаты. При проведении прямой радиойодинизации DARPin9_29 радиохимический выход составил 96,2±0,7%, радиохимическая чистота – 99,7±0,5%; показатели стабильности в растворе PBS через 1 ч – 99,7±0,4, через 3 ч – 97,9±1,0. По результатам исследования in vitro показана связь накопления соединения с уровнем экспрессии рецептора Her2/neu в изучаемых клеточных линиях. Блокирование рецепторов избытком немеченого протеина продемонстрировало значительное снижение связывания. По результатам in vivo исследований основными характеристиками соединения являлись быстрое выведение из кровотока, а также относительно невысокие показатели захвата изучаемого соединения легкими, печенью и селезенкой, почками и костями. По результатам однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (КТ)/КТ для лабораторных животных Her2/neu-опухоли отчетливо визуализировались во всех случаях, также отмечалось существенное накопление радиоиндикатора в мочевом пузыре. Заключение. Выполненные исследования продемонстрировали создание нового стабильного соединения с высокими показателями радиохимических выхода и чистоты. Данные исследований in vitro и in vivo показали высокую чувствительность и специфичность изучаемого препарата к рецептору Her2/neu.
Ключевые слова: 
Her2/neu, радионуклидная диагностика, DARPins

Список литературы: 
  1. Zavyalova M., Vtorushin S., Krakhmal N., Savelieva O., Tashireva L., Kaigorodova E., Perelmuter V., Telegina N., Denisov E., Bragina O., Slonimskaya E., Choynzonov E. Clinicopathological features of nonspecific invasive breast cancer according to its molecular subtypes. Experimental Oncology. 2016; 38 (2): 122–7.
  2. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G. Levin W.J., Ullrich A., McGuire W.L. Human breast cancer: correlation of relapse a survival with amplification of the Her-2/neu oncogenes. Science. 1987; 235: 177–82.
  3. Romond E.H., Perez E.A., Bryant J., Suman V.J., Geyer C.E. Jr., Davidson N.E., Tan-Chiu E., Martino S., Paik S., Kaufman P.A., Swain S.M., Pisansky T.M., Fehrenbacher L., Kutteh L.A., Vogel V.G., Visscher D.W., Yothers G., Jenkins R.B., Brown A.M., Dakhil S.R., Mamounas E.P., Lingle W.L., Klein P.M., Ingle J.N., Wolmark N. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N. Engl. J. Med. 2005; 353: 1673–84.
  4. Zahid M., Khan S., Khan R. Detection of Her2/neu gene amplification by fluoroscence in situ hybridization technique. Pathology. 2016; 48 (1): 163–70.
  5. Orlando L., Viale G., Bria E. Lutrino E.S., Sperduti I., Carbognin L., Schiavone P., Quaranta A., Fedele P., Caliolo C., Calvani N., Criscuolo M., Cinieri S. Discordance in pathology report after central pathology review: Implications for breast cancer adjuvant treatment. Breast. 2016; 30: 151–5.
  6. Telugu R.B., Chowhan A.K., Rukmangadha N., Patnayak R., Phaneendra B.V., Prasad B.C., Reddy M.K. Human epidermal growth factor receptor 2/neu protein expression in meningiomas: An immunohistochemical study. J. Neurosci Rural Pract. 2016; 7 (4): 526–31.
  7. Чернов В.И., Медведева А.А., Синилкин И.Г., Зельчан Р.В., Брагина О.Д., Чойнзонов Е.Л. Ядерная медицина в диагностике и адресной терапии злокачественных новообразований. Бюллетень сибирской медицины. 2018; 17 (1): 220–31. [Chernov V.I., Medvedeva A.A., Sinilkin I.G., Zelchan R.V., Bragina O.D., Choinzonov E.L. Nuclear medicine as a tool for diagnosis and targeted cancer therapy. Bulleten Sibirskoi Medicini. 2017; 16 (3): 25–33 (in Russian)]
  8. Чернов В.И., Брагина О.Д., Синилкин И.Г., Медведева А.А., Зельчан Р.В. Радионуклидная тераностика злокачественных образований. Вестник рентгенологии и радиологии. 2016; 97 (5): 306–13. [Chernov V.I., Bragina O.D., Sinilkin I.G., Medvedeva A.A., Zel’chan R.V. Radionuclide terorectics of malignant tumors. Vestnik rentgenologii i radiologii. 2016; 97 (5): 306–13 (in Russian)]
  9. Stumpp M. T., Binz H.K., Amstutz P. DARPins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today. 2008; 13 (15): 695–701.
  10. Tamaskovic R., Simon M., Stefan N., Schwill M., Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins) from research to therapy. Methods Enzymol. 2012; 503: 101–34.
  11. Boersma Y.L., Pluckthun A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. Curr. Opin. Biotechnol. 2011; 22: 849–57.
  12. Binz H.K., Stumpp M.T., Forrer P., Amstutz P., Pluckthun A. Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins. J. Mol. Biol. 2003; 332: 489–503.
  13. Брагина О.Д., Ларькина М.С., Стасюк Е.С., Чернов В.И., Юсубов М.С., Скуридин В.С., Деев С.М., Зельчан Р.В., Булдаков М.А., Подрезова Е.В., Белоусов М.В. Разработка высокоспецифичного радиохимического соединения на основе меченых 99mТс рекомбинантных адресных молекул для визуализации клеток с гиперэкспрессией Her-2/neu. Бюллетень сибирской медицины. 2017; 16 (3): 25–33. [Bragina O.D., Larkina M.S., Stasyuk E.S., Chernov V.I., Yusubov M.S., Skuridin V.S., Deyev S.M., Zelchan R.V., Buldakov M.A., Podrezova E.V., Belousov M.V. Development of highly specific radiochemical compounds based on 99mTc-labeled recombinant molecules for targeted imaging of cells overexpressing Her-2/neu. Bulleten Sibirskoi Medicini. 2017; 16 (3): 25–33 (in Russian)]
  14. Bragina O., Larkina M., Stasyuk E., Chernov V., Zelchan R., Medvedeva A., Sinilkin I., Yusubov M., Skuridin V., Deyev S., Buldakov M.. In vitro evaluation of a specific radiochemical compound based on 99mTc-labeled DARPinG3 for radionuclide imaging of tumors overexpressing Her-2/neu. AIP Conference Proceedings 1882, 020007 (2017); https://doi.org/10.1063/1.5001586.
  15. Goldstein R., Sosabowski J., Livanos M., Leyton J., Vigor K., Bhavsar G., Nagy-Davidescu G., Rashid M., Miranda E., Yeung J., Tolner B., Plückthun A., Mather S., Meyer T., Chester K.. Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 for HER2 molecular imaging. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 2015; 42 (2): 288–301.
  16. Lindbo S., Garousi J., Mitran B., Altai M., Buijs J., Orlova A., Hober S., Tolmachev V. Radionuclide Tumor Targeting Using ADAPT Scaffold Proteins: Aspects of Label Positioning and Residualizing Properties of the Label. J. Nucl. Med. 2018; 59 (1): 93–9.
  17. Tolmachev V., Orlova A., Andersson K. Methods for radiolabelling of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 2014; 1060: 309–30.
  18. Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55: 489–511.
  19. Garousi J., Honarvar H., Andersson K.G., Mitran B., Orlova A., Buijs J., Löfblom J., Frejd F.Y., Tolmachev V. Comparative Evaluation of Affibody Molecules for Radionuclide Imaging of in Vivo Expression of Carbonic Anhydrase IX. Mol. Pharm. 2016; 13 (11): 3676–87.
  20. Nicholes N., Date A., Beaujean P., Hauk P, Kanwar M, Ostermeier M. Modular protein switches derived from antibody mimetic proteins. Protein Engineering, Design and Selection. 2016; 29: 77–85.
  21. Hausammann S., Vogel M., Kremer J.A. Designed Ankyrin Repeat Proteins: A New Approach to Mimic Complex Antigens for Diagnostic Purposes? PLoS One. 2013; 8: 1–9.
  22. Moody P., Chudasama V., Nathani R.I., Maruani A., Martin S., Smith M.B., Caddick S. A rapid, site-selective and efficient route to the dual modification of DARPins. Chem Commun (Camb). 2014: 50 (38): 4898–900.
  23. Kramer L., Renko M., Završnik J., Turk D., Seeger M.A., Vasiljeva O., Grütter M.G., Turk V., Turk B. Non-invasive in vivo imaging of tumour-associated cathepsin B by a highly selective inhibitory DARPin. Theranostics. 2017; 8: 2806–21.
  24. Houlihan G., Gatti-Lafranconi P., Lowe D., Hollfelder F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Eng Des Sel. 2015; 28 (9): 269–79.
  25. Hanenberg M., McAfoose J., Kulic L. Amyloid-β peptide-specific DARPins as a novel class of potential therapeutics for Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 2014; 26: 27080–9.