ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА МУЛЬТИТАРГЕТНОЙ ОДНОНУКЛЕОТИДНОЙ ЭЛОНГАЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ

DOI: https://doi.org/10.29296/24999490-2019-02-06

А.А. Мусаелян(1), И.В. Чистяков(1), кандидат медицинских наук, В.Д. Назаров(1), С.В. Лапин(1), кандидат медицинских наук, М.В. Согоян(1), С.Е. Хальчицкий(2), кандидат биологических наук, В.Л. Эмануэль(1), доктор медицинских наук, профессор, Т.В. Лобачевская(1), кандидат медицинских наук, А.Л. Акопов(1), доктор медицинских наук, профессор 1-ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Минздрава России, Российская Федерация, 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6–8; 2-ФГБУ «Научно-исследовательский детский ортопедический институт имени Г.И. Турнера» Минздрава России, Российская Федерация, 196603, Санкт-Петербург, Пушкин, ул. Парковая, д. 64–68 E-mail: [email protected]

Введение. Молекулярное профилирование опухолевого материала необходимо для персонализированного подхода в лечении пациентов со злокачественными новообразованиями. Выявление соматических мутаций новообразований в генах EGFR и KRAS позволяет прогнозировать течение заболевания и индивидуализировать терапию. Одним из высокочувствительных методов для детекции точечных мутаций является мультитаргетная однонуклеотидная элонгация (МОЭ). Цель. Оптимизировать метод МОЭ для детекции клинически значимых аберраций в генах EGFR и KRAS в опухолевом материале. Материал и методы. Генетический материал был выделен из 31 образца немелкоклеточного рака легкого, из которых 9 были фиксированы формалином и залиты парафином. Основные лабораторные характеристики МОЭ сравнивали с показателями полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, цифровой ПЦР и секвенированием по Сэнгеру. Результаты. Создан протокол для верификации аберраций в генах EGFR и KRAS. Определен порог чувствительности метода МОЭ, который составил 48 копий/мкл мутантной ДНК. Было показано, что лабораторные характеристики метода сопоставимы с ПЦР в реальном времени. МОЭ способен детектировать аберрации в опухолевом материале, фиксированным формалином и залитым парафином. По нашим данным, МОЭ превосходит прямое секвенирование по Сэнгеру по количеству выявленных точечных мутаций: соответственно 26 и 3%. Заключение. МОЭ является высокочувствительным и сравнительно быстрым многопараметрическим методом генотипирования опухолевого материала.
Ключевые слова: 
соматические мутации, таргетная терапия, немелкоклеточный рак легкого
Для цитирования: 
Мусаелян А.А., Чистяков И.В., Назаров В.Д., Лапин С.В., Согоян М.В., Хальчицкий С.Е., Эмануэль В.Л., Лобачевская Т.В., Акопов А.Л. ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА МУЛЬТИТАРГЕТНОЙ ОДНОНУКЛЕОТИДНОЙ ЭЛОНГАЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ. Молекулярная медицина, 2019; (2): -https://doi.org/10.29296/24999490-2019-02-06
Список литературы: 
  1. Srinivasan M., Sedmak D., Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am. J. Pathol. 2002. https://doi.org/10.1016/S0002-9440(10)64472-0.
  2. Gerlinger M., Rowan A.J., Horswell S., Larkin J., Endesfelder D., Gronroos E. et al. Intratumor Heterogeneity and Branched Evolution Revealed by Multiregion Sequencing. N. Engl. J. Med. 2012. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1113205.
  3. Dias-Santagata D., Akhavanfard S., David S.S., Vernovsky K., Kuhlmann G., Boisvert S.L. et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: A clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2010. https://doi.org/10.1002/emmm.201000070.
  4. Lovly C.M., Dahlman K.B., Fohn L.E., Su Z., Dias-Santagata D., Hicks D.J. et al. Routine multiplex mutational profiling of melanomas enables enrollment in genotype-driven therapeutic trials. PLoS One. 2012. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035309.
  5. Sequist L.V., Heist R.S., Shaw A.T., Fidias P., Rosovsky R., Temel J.S. et al. Implementing multiplexed genotyping of non-small-cell lung cancers into routine clinical practice. Ann Oncol. 2011. https://doi.org/10.1093/annonc/mdr489.
  6. Cernomaz A.T., Macovei I.I., Pavel I., Grigoriu C., Marinca M., Baty F. et al. Comparison of next generation sequencing, SNaPshot assay and real-time polymerase chain reaction for lung adenocarcinoma EGFR mutation assessment. BMC Pulm Med. 2016; 16. https://doi.org/10.1186/s12890-016-0250-0.
  7. Zhao Y., Zhang X.-Y., Guo J.-J., Zeng A.-Z., Hu J.-L., Huang W.-X. et al. Simultaneous Genotyping and Quantification of Hepatitis B Virus for Genotypes B and C by Real-Time PCR Assay. J. Clin. Microbiol. 2010; 48: 3690 LP-3697.
  8. Jakobsen M.R., Tolstrup M., Søgaard O.S., Jørgensen L.B., Gorry P.R., Laursen A. et al. Transmission of HIV-1 Drug-Resistant Variants: Prevalence and Effect on Treatment Outcome. Clin Infect Dis. 2010. https://doi.org/10.1086/650001.
  9. Li Q., Yang F., Liu R., Luo L., Yang Y., Zhang L. et al. Prevalence and molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency at the China-Myanmar border. PLoS One. 2015. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0134593.
  10. Chen Y., Liu Y., Wang B., Mao J., Wang T., Ye K. et al. Development and validation of a fetal genotyping assay with potential for noninvasive prenatal diagnosis of hereditary hearing loss. Prenat Diagn. 2016. https://doi.org/10.1002/pd.4962.
  11. Palacajornsuk P., Halter C., Isakova V., Tarnawski M., Farmar J., Reid M.E. et al. Detection of blood group genes using multiplex SNaPshot method. Transfusion. 2009. https://doi.org/10.1111/j.1537-2995.2008.02053.x.
  12. Mehta B., Daniel R., Phillips C., McNevin D. Forensically relevant SNaPshot® assays for human DNA SNP analysis: a review. Int J. Legal Med. 2017. https://doi.org/10.1007/s00414-016-1490-5.
  13. van Oers J.M.M., Lurkin I., van Exsel A.J.А., Nijsen Y., van Rhijn B.W.G., van der Aa M.N.M. et al. A simple and fast method for the simultaneous detection of nine fibroblast growth factor receptor 3 mutations in bladder cancer and voided urine. Clin. Cancer Res. 2005. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-05-1045.
  14. Smith D.L., Lamy A., Beaudenon-Huibregtse S., Sesboüé R., Laosinchai-Wolf W., Sabourin J.C. et al. A multiplex technology platform for the rapid analysis of clinically actionable genetic alterations and validation for BRAF p.V600E detection in 1549 cytologic and histologic specimens. Arch Pathol Lab Med. 2014. https://doi.org/10.5858/arpa.2013-0002-OA.
  15. Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С., Овчинникова Л.К., Дигаева М.А., Воротников И.К., Давыдов М.И. Биологические маркеры опухолей в клинике достижения, проблемы, перспективы. Российский биотерапевтический журнал. 2009; 3.
  16. [Kushlinskii N.E., Gershtein E.S., Ovchinnikova L.K., Digaeva M.A., Vorotnikov I.K., Davydov M.I. The tumor biological markers in the clinic achievements, problems, prospects. Rossijskij bioterapevticheskij zhurnal Rossijskij bioterapevticheskij zhurnal. 2009; 3 (in Russian)]
  17. Su Z., Dias-Santagata D., Duke M., Hutchinson K., Lin Y.L., Borger D.R. et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagnostics. 2011; 13: 74–84. https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2010.11.010.
  18. Kawamura T., Kenmotsu H., Omori S., Nakashima K., Wakuda K., Ono A. et al. Clinical Factors Predicting Detection of T790M Mutation in Rebiopsy for EGFR-Mutant Non–small-cell Lung Cancer. Clin. Lung Cancer. 2018; 19: 247–52. https://doi.org/10.1016/j.cllc.2017.07.002.
  19. Lavdovskaia E.D., Iyevleva A.G., Sokolenko A.P., Mitiushkina N.V., Preobrazhenskaya E.V., Tiurin V.I. et al. EGFR T790M Mutation in TKI-Naive Clinical Samples: Frequency, Tissue Mosaicism, Predictive Value and Awareness on Artifacts. Oncol Res Treat. 2018; 41. https://doi.org/10.1159/000491441.
  20. Perizzolo M., Winkfein B., Hui S., Krulicki W., Chan J.A., Demetrick D.J. IDH mutation detection in formalin-fixed paraffin-embedded gliomas using multiplex PCR and single-base extension. Brain Pathol. 2012. https://doi.org/10.1111/j.1750-3639.2012.00579.x.