Сравнение чувствительности рестрикционного анализа и ПЦР с анализом кривых плавления в высоком разрешении для выявления мутации R882H в гене DNMT3A

DOI: https://doi.org/10.29296/24999490-2023-06-04

Е.Д. Кулаева(1), Е.С. Музлаева(1), П.В. Липилкин(2, 3), Е.В. Машкина(1)
1-ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет»
Минобрнауки России, Академия биологии и биотехнологии,
Российская Федерация, 344090, Ростов-на-Дону, пр-т Стачки 194/1;
2-Ростовский государственный медицинский университет,
Российская Федерация, 344022, Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29;
3-Донской государственный технический университет,
Российская Федерация, 344000, Ростов-на-Дону, пл. Гагарина, 1

Введение. DNMT3A является одним из наиболее часто мутирующих генов при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ), а замена R882H (G>A) является одной из наиболее частых мутаций в этом гене. Рестрикционный анализ и анализ кривых плавления с высоким разрешением (high resolution melting, HRM) являются наиболее распространенными методами, используемыми для выявления этой мутации, однако чувствительность этих подходов сильно варьирует от исследования к исследованию. Цель исследования. Определение чувствительности широкораспространенных методов для оценки содержания мутации R882H в пробе в контролируемых условиях. Методы. Мы сравнили чувствительность рестрикционного анализа и HRM на образцах заранее синтезированной ДНК с различным содержанием мутантной матрицы в образце и привели подробные протоколы для воспроизведения наших результатов другими исследователями. Результаты. Установлено, что предел обнаружения мутации R882H в гене DNMT3A составляет 20% для рестрикционного анализа и 40% для HRM. Заключение. Полученные в данной работе результаты важны для определения рестрикционного анализа и HRM как подходящих методов для использования в лабораторной диагностике мутации R882H для пациентов с ОМЛ при высокой мутационной нагрузке.
Ключевые слова: 
DNMT3A, рестрикционный анализ, анализ кривых плавления с высоким разрешением
Для цитирования: 
Кулаева Е.Д., Музлаева Е.С., Липилкин П.В., Машкина Е.В. Сравнение чувствительности рестрикционного анализа и ПЦР с анализом кривых плавления в высоком разрешении для выявления мутации R882H в гене DNMT3A. Молекулярная медицина, 2023; (6): 27-32https://doi.org/10.29296/24999490-2023-06-04
Список литературы: 
  1. De Kouchkovsky I., Abdul-Hay M. Acute myeloid leukemia: a comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer J. 2016; 6 (7): e441. https://doi.org/10.1038/bcj.2016.50.
  2. Hou H.A., Tien H.F. Genomic landscape in acute myeloid leukemia and its implications in risk classification and targeted therapies. J Biomed Sci. 2020; 27 (1): 81. https://doi.org/10.1186/s12929-020-00674-7.
  3. Que Y., Li H., Lin L., Zhu X., Xiao M., Wang Y., Zhu L., Li D. Study on the Immune Escape Mechanism of Acute Myeloid Leukemia With DNMT3A Mutation. Front Immunol. 2021; 12: 653030. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.653030.
  4. Venugopal K., Feng Y., Shabashvili D., Guryanova O.A. Alterations to DNMT3A in Hematologic Malignancies. Cancer Res. 2021; 81 (2): 254–63. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-20-3033.
  5. Rajavelu A., Jurkowska R.Z., Fritz J., Jeltsch A. Function and disruption of DNA Methyltransferase 3a cooperative DNA binding and nucleoprotein filament formation. Nucleic Acids Res. 2012; 40 (2): 569–80. https://doi.org/10.1093/nar/gkr753.
  6. Anteneh H., Fang J., Song J. Structural basis for impairment of DNA methylation by the DNMT3A R882H mutation. Nat. Commun. 2020; 11 (1): 1–12. https://doi.org/10.1038/s41467-020-16213-9.
  7. Guryanova O.A., Shank K., Spitzer B., Luciani L., Koche R.P., Garrett-Bakelman F.E., Ganzel C., Durham B.H., Mohanty A., Hoermann G., Rivera S.A., Chramiec A.G., Pronier E., Bastian L., Keller M.D., Tovbin D., Loizou E., Weinstein A.R., Gonzalez A.R,. Lieu Y.K., Rowe J.M., Pastore F., McKenney A.S., Krivtsov A.V., Sperr W.R., Cross J.R., Mason C.E., Tallman M.S., Arcila M.E., Abdel-Wahab O., Armstrong S.A., Kubicek S., Staber P.B., Gönen M., Paietta E.M., Melnick A.M., Nimer S.D., Mukherjee S., Levine R.L. DNMT3A mutations promote anthracycline resistance in acute myeloid leukemia via impaired nucleosome remodeling. Nat. Med. 2016; 22 (12): 1488–95. https://doi.org/10.1038/nm.4210.
  8. Hou H.A., Kuo Y.Y., Liu C.Y., Chou W.C., Lee M.C., Chen C.Y., Lin LI, Tseng M.H., Huang C.F., Chiang Y.C., Lee F.Y., Liu M.C., Liu C.W., Tang J.L., Yao M., Huang S.Y., Ko B.S., Hsu S.C., Wu S.J., Tsay W., Chen Y.C., Tien H.F. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia: stability during disease evolution and clinical implications. Blood. 2012; 119 (2): 559–68. https://doi.org/10.1182/blood-2011-07-369934.
  9. Berenstein R., Blau I.W., Suckert N., Baldus C., Pezzutto A., Dörken B., Blau O. Quantitative detection of DNMT3A R882H mutation in acute myeloid leukemia. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2015; 34 (1): 55. https://doi.org/10.1186/s13046-015-0173-2.
  10. Singh R.R., Bains A., Patel K.P., Rahimi H., Barkoh B.A., Paladugu A., Bisrat T., Ravandi-Kashani F., Cortes J.E., Kantarjian H.M., Medeiros L.J., Luthra R. Detection of High-Frequency and Novel DNMT3A Mutations in Acute Myeloid Leukemia by High-Resolution Melting Curve Analysis. J. Mol. Diagn. 2012; 14 (4): 336–45. https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2012.02.009.
  11. Berenstein R., Blau I.W., Kar A., Cay R., Sindram A., Seide C., Blau O. Comparative examination of various PCR-based methods for DNMT3A and IDH1/2 mutations identification in acute myeloid leukemia. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2014; 33 (1): 44. https://doi.org/10.1186/1756-9966-33-44.
  12. Gonzalez-Bosquet J., Calcei J., Wei J.S., Garcia-Closas M., Sherman M.E., Hewitt S., Vockley J., Lissowska J., Yang H.P., Khan J., Chanock S. Detection of Somatic Mutations by High-Resolution DNA Melting (HRM) Analysis in Multiple Cancers. PLoS One. 2011; 6 (1): 14522. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014522.
  13. Jeziskova I., Musilova M., Culen M., Foltankova V., Dvorakova D., Mayer J., Racil Z. Distribution of mutations in DNMT3A gene and the suitability of mutations in R882 codon for MRD monitoring in patients with AML. Int. J. Hematol. 2015; 102 (5): 553–7. https://doi.org/10.1007/s12185-015-1856-3.
  14. Do H., Dobrovic A. Limited copy number-high resolution melting (LCN-HRM) enables the detection and identification by sequencing of low level mutations in cancer biopsies. Mol Cancer. 2009; 8: 82. https://doi.org/10.1186/1476-4598-8-82.