СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТЕЛОМЕРАЗЫ МЕТОДОМ ДВОЙНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ТЕЛОМЕРНЫХ ПОВТОРОВ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

DOI: https://doi.org/10.29296/24999490-2018-04-08

А.И. Глухов(1, 2, 3), доктор биологических наук, Д.С. Налобин(1, 3), кандидат биологических наук, С.А. Гордеев(1, 2, 3), кандидат биологических наук, С.Н. Калабушев(1, 3) 1-Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Российская Федерация, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1; 2-Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России, Российская Федерация, 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2; 3-Научно-исследовательский центр молекулярной биомедицины, Российская Федерация, 143026, Москва, территория инновационного центра «Сколково», ул. Малевича, д. 1 E-mail: Denis.Nalobin@gmail.com

Введение. Теломеразная активность является универсальным маркером для 85% злокачественных опухолей. Это позволяет разрабатывать современные высокочувствительные и высокоспецифичные наборы для диагностики большинства злокачественных новообразований, в том числе на ранних стадиях заболевания. Существующие методы определения активности теломеразы считаются недостаточно эффективными, когда анализируется недостаточное количество клеточного материала. Это делает невозможным проведение неинвазивного варианта диагностики ряда заболеваний, когда количество клеточного материала очень мало. В связи с этим разработка более чувствительных вариантов определения активности теломеразы остается крайне актуальной задачей биологии и медицины. Цель исследования. Разработка высокочувствительного и высокоспецифичного метода определения активности теломеразы в реальном времени. Материал и методы. Предложен новый способ выявления, а также количественного определения активности теломеразы RT-TRAP-2PCR (Real-Time – Telomeric Repeat Amplification Protocol – 2 Polymerase Chain Reaction) в биологических образцах эукариотических организмов методом двойной амплификации теломерных повторов в реальном времени, основанном на измерении суммарного содержания теломерных повторов, новосинтезированных теломеразой в анализируемом образце. Результаты. Данный способ позволяет обеспечить высокую чувствительность и специфичность метода, в том числе при проведении анализа в биологических образцах, характеризующихся низким содержанием теломеразопозитивных клеток и присутствием ингибиторов теломеразы. Метод относится к биологии, медицине, онкологии, ветеринарии, репродуктологии и может быть использован, в частности, для определения активности теломеразы при диагностике злокачественных новообразований, на подготовительных этапах при применении вспомогательных репродуктивных технологий, научных исследованиях. Заключение. Предложенный метод позволяет проводить не только качественный, но и количественный анализ активности теломеразы в образце. Метод дает возможность анализа теломеразной активности в присутствии различных примесей нуклеиновых кислот, белков и других компонентов клеток и тканей, характерных для клинических образцов, при этом для диагностики могут оказаться пригодны образцы, полученные неинвазивными и малоинвазивными способами.
Ключевые слова: 
теломеры, теломераза, активность, TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol), RT-TRAP-2PCR (Real-Time – Telomeric Repeat Amplification Protocol – 2 Polymerase Chain Reaction)

Список литературы: 
  1. Nalobin D.S., Galiakberova A.A., Alipkina S.I., Glukhov A.I. Regulation of Telomerase Activity. Biol. Bulletin Reviews. 2018; 8 (2): 142–54.
  2. Глухов А.И., Григорьева Я.Е., Гордеев С.А., Налобин Д.С., Потолдыкова Н.В. Теломераза как потенциальный онкомаркер при разработке неинвазивной диагностики ранней стадии рака мочевого пузыря. Молекулярная медицина. 2017; 15 (2): 20–7. [Gluhov A.I., Grigor’eva Ja.E., Gordeev S.A., Nalobin D.S., Potoldykova N.V. Telomeraza kak potencial’nyj onkomarker pri razrabotke neinvazivnoj diagnostiki rannej stadii raka mochevogo puzyrja. Molekuljarnaja medicina. 2017; 15 (2): 20–7 (in Russian)]
  3. Глухов А.И., Налобин Д.С., Лесничук С.А., Мирошниченко Д.В., Гордеев С.А. Распределение теломеразной активности в узловых образованиях щитовидной железы при пункционной гистобиопсии. Молекулярная медицина. 2017; 15 (6): 21–4. [Gluhov A.I., Nalobin D.S., Lesnichuk S.A., Miroshnichenko D.V., Gordeev S.A. Raspredelenie telomeraznoj aktivnosti v uzlovyh obrazovanijah shhitovidnoj zhelezy pri punkcionnoj gistobiopsii. Molekuljarnaja medicina. 2017; 15 (6): 21–4 (in Russian)]
  4. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., Harley C.B., West M.D., Ho P.L., Coviello G.M., Wright W.E., Weinrich S.L., Shay J.W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 1994; 266 (5193): 2011–5.
  5. Elmore L.W., Forsythe H.L., Ferreira-Gonzalez A., Garrett C.T., Clark G.M., Holt S.E. Real-time quantitative analysis of telomerase activity in breast tumor specimens using a highly specific and sensitive fluorescent-based assay. Diagn Mol Pathol. 2002; 11 (3): 177–85.
  6. Hou M., Xu D., Bjorkholm M., Gruber A. Real-Time Quantitative Telomeric Repeat Amplification Protocol Assay for the Detection of Telomerase Activity. Clin. Chem. 2001; 47: 519–24.
  7. Jakupciak J.P., Barker P.E., Wang W., Srivastava S., Atha D.H. Preparation and Characterization of Candidate Reference Materials for Telomerase Assays. Clin. Chemistry. 2005; 51 (8): 1443–50.
  8. Краевая Е.Е., Налобин Д.С., Глухов А.И., Макарова Н.П., Калинина Е.А. Прогнозирование исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий путем определения длины теломер и активности теломеразы в клетках кумулюса и лимфоцитах крови. Акушерство и гинекология. 2017; 12: 16–20. [Kraevaja E.E., Nalobin D.S., Gluhov A.I., Makarova N.P., Kalinina E.A. Prognozirovanie ishodov programm vspomogatel’nyh reproduktivnyh tehnologij putem opredelenija dliny telomer i aktivnosti telomerazy v kletkah kumuljusa i limfocitah krovi. Akusherstvo i ginekologija. 2017; 12: 16–20 (in Russian)]
  9. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248–54.
  10. Grimm J., Perez J.M., Josephson L., Weissleder R. Novel nanosensors for rapid analysis of telomerase activity. Cancer Res. 2004; 15 (64 (2)): 639–43.